王鲁宁,1,2,刘丽君1,岩雨1,3,杨坤1,陆黎立1

生物医用金属材料植入人体后，表面会与体液迅速发生一系列反应，包括腐蚀。腐蚀过程中释放的金属离子及形成的腐蚀产物会干扰周围细胞的行为，进而影响植入体周围组织的微环境[1]。腐蚀还会影响材料在体内的安全服役寿命。均匀腐蚀会使材料截面不断减少，但在达到材料断裂强度前仍可维持一定的力学性能，保持其支撑作用；而局部腐蚀会导致应力集中并引发疲劳断裂，具有突发性，会大大缩短材料的服役时间。因此，腐蚀行为是评价医用金属材料性能的标准之一。

研究生物医用材料降解性能最理想的方法是动物体内实验，然而较高的测试成本和有限的测试数量，使得体外测试成为初始研究阶段不可缺少的部分。但是，体外测试结果能否作为预测体内降解的可靠依据仍需探讨。以镁合金为例，Sanchez等[2]比较了2015年之前体内外测试中镁合金的腐蚀速率，本文作者总结了近两年关于镁合金的部分研究数据(表1[3~7])，在考虑实验条件(测试方法、时间、溶液等)差异的情况下，将同一种材料的腐蚀速率加和后计算得到平均值，进行对比(图1)。结果表明，相同的镁合金材料在体内外测试中的腐蚀速率存在或多或少的差异。因此，体外测试结果并不能完全作为体内降解行为的推断依据。目前，体外测试方法尚不完善[8,9]，研究中有必要关注以下问题：(1) 改进体外测试模型，尽可能地模拟体内环境；(2) 确定造成体内外腐蚀差异的因素；(3) 确定金属材料在体内的降解模型。但是，实时监测金属材料在体内的腐蚀具有一定的难度[2]。因此，需要尽可能改进体外测试方法，并找出体内外测试差异的原因。

表1Mg及镁合金体内外测试中的腐蚀速率[3~7](mm/a, unless otherwise indicated)

Table 1Thein vitroandin vivocorrosion rates of Mg and Mg alloys[3-7]

新窗口打开|下载CSV

1蛋白质在医用金属材料表面的吸附

1.1蛋白质在医用金属材料表面的吸附机理

血浆中主要的蛋白质有白蛋白、球蛋白和纤维蛋白。其中，白蛋白的浓度最高(约60%)，并且对蛋白质的初始吸附起到重要作用[10,30]。人体血清蛋白(human serum albumin，HSA)包含585个氨基酸，17个二硫键，一个自由的巯基—SH和一个色氨酸，具有良好的配体结合性能[31]。体外测试中，BSA被广泛用于模拟体内蛋白质。BSA与HSA的结构相似(图2)，一级结构包含3个部分(I、II、III)，每部分又包含2个螺旋结构(A和B)。BSA的等电点为4.7~5.2，在中性环境条件下，氨基酸中的—COOH失去质子，使BSA分子带负电荷。以下以BSA为例，综述蛋白质在金属表面的吸附及其对腐蚀行为的影响。

图2

图2牛血清白蛋白(BSA，PDB bank：4f5s)的结构示意图

Fig.2Schematic of BSA (PDB bank: 4f5s) structure (BSA—bovine serum albumin)

蛋白质在金属表面的吸附主要通过疏水作用、van der Waals力、静电吸引、共价键等方式[32~34]。研究[35]发现，在醋酸钠溶液中，BSA通过水合作用、静电吸引作用与TiO2表面结合，低浓度BSA在吸附过程中可能会发生构象改变。对于CoCrMo合金[36]，表面不带电时，疏水作用控制BSA的吸附过程，并且BSA分子侧向吸附在表面，形成单分子层。而当表面带正电荷时，静电吸引对BSA的吸附起主导作用，BSA的最大吸附量发生在等电点。也有研究[29]指出，BSA内部的二硫键具有催化作用，也会促使分子与金属表面结合。二硫键会被金属还原，形成蛋白质-金属络合物，之后二硫键被O2氧化，这一过程的不断重复导致了蛋白质的交联和沉积。分子动力学模拟(MD)为分子水平上对蛋白质吸附机理的认识提供了可能[37,38]。以BSA为例[39]，利用Materials Studio模拟可得知，BSA通过氨基酸中—CH3吸附在疏水表面，—COOH则参与亲水表面的反应(图3[39])。

图3

图3分子动力学模拟BSA在2种表面吸附后的优化构型[39]

Fig.3Optimized complexes of BSA on polystyrene (PS) surface (a) and BSA on the GeO2surface (b)[39]

1.2蛋白质在医用金属材料表面吸附的影响因素

蛋白质在金属表面的吸附受多种因素的影响[40,41]，不同类型的蛋白质、不同的金属材料以及不同的溶液pH值都会导致蛋白质的吸附结果不同。Lundin等[42]利用石英晶体微天平(quartz crystal microbalance，QCM)研究了不同类型的蛋白质(如表4[42]所示)在316L不锈钢表面的吸附。溶液pH=4时，316L表面带正电荷，pH=7.4时则带负电荷。2种pH值条件下，牛颌下腺粘蛋白(submaxillary gland mucim，BSM)都带负电荷。从静电吸引角度看，pH=4时BSM的吸附量更高。此时，HSA和Cr表面都带正电荷，相同电荷的排斥作用会减少HSA的吸附量。但是结果表明，由于HSA的羧基和不锈钢表面的Cr(III)氢氧化物之间形成了很强的共价键，HSA的吸附量仍然较高。白蛋白和粘蛋白的内部构象稳定性低，在金属表面的吸附与静电吸引作用无关，因此在316L表面的吸附与溶液pH值无关。溶菌酶(lysozyme，LYS)具有较高的内部构象稳定性，一般不会吸附在带有相同电荷的亲水表面。因此，pH=4时，LYS在316L表面的吸附量较少。在Wagener等[43]的研究中，BSA和LYS在Mg和Fe表面的吸附均与静电吸引作用有关。中性条件下，带负电的BSA在MgO/Mg(OH)2表面的吸附量较高，而带正电荷的LYS则在带负电的铁表面吸附较多(图4)。

表4不同蛋白质的结构、尺寸、分子量及等电点[42]

Table 4The structure, size, molecular weight, and isoelectric point of different kinds of proteins[42]

新窗口打开|下载CSV

图4

图4在模拟体液中，蛋白质通过静电吸引作用吸附在材料表面

(a) BSA adsorbs on Mg surface with positive charges

(b) LYS adsorbs on Fe surface with negative charges

Fig.4Protein adsorption on the materials in SBF

当金属表面带有特定官能团或亲水性不同时，蛋白质的吸附状况也不相同。Roach等[44]利用石英晶体天平和掠射角红外光谱研究了BSA和Fg在亲水(含有—OH)、疏水(—CH3)表面的吸附情况。BSA在疏水表面的结合常数高于亲水表面(表5[44])，但是分子结构的有序程度降低，在材料表面的覆盖率也降低。因此，测试结果显示BSA在亲水表面的吸附量反而更高。与BSA相比，Fg会更快速地吸附在2种表面。2种蛋白质都会在1 h内快速吸附在2种表面，之后由吸附引起的构象改变便会减少。另外，在研究的浓度范围内，BSA在材料表面的吸附只有一个过程，但是Fg在浓度高于0.5 mg/mL时会发生多级吸附：初始阶段，Fg分子长轴平行于材料表面；之后由于表面吸附位点减少，分子之间的疏水作用导致吸附的Fg分子发生重排，长轴垂直于表面，以便更多的分子吸附在表面。

表5BSA和纤维蛋白在材料表面的结合常数和吸附饱和值[44]

Table 5Binding constants and saturation values for BSA and Fg[44]

新窗口打开|下载CSV

2.3蛋白质存在时金属材料的腐蚀机理

综上所述，体外测试中，蛋白质会对医用金属材料的腐蚀行为产生不同的影响，并且与多种因素有关，如金属材料的成分[64]、蛋白质的浓度与种类[11,35,42]、测试时间[15,27,85]、测试方法的选择[56,58]等。各种因素的差异也导致了蛋白质对腐蚀的影响没有一致的结果。但是目前，研究者一致认为蛋白质改变金属材料腐蚀行为的机理主要是吸附与螯合：蛋白质吸附在材料表面后形成的分子层有一定的屏障作用，可以阻碍界面的物质传输，增加电荷转移电阻[68]；与Cl-等腐蚀性离子比较，带负电的蛋白质可更牢固地吸附在材料表面，占据O2的反应位点，或阻碍O2传输，从而抑制阴极反应[86]；但是表面缺氧又会导致氧化物致密性降低，腐蚀性离子会穿过膜层中的孔洞到达基体表面，加快金属溶解。此过程中，金属离子与蛋白质之间的螯合作用可能会促进离子溶解，导致腐蚀加快[87]。

Khan等[55]以Ti-6Al-4V、Ti-6Al-7Nb和Ti-13Nb-13Zr 3种钛合金为例，解释了BSA吸附与金属腐蚀的关系。如图9[55]所示，初始阶段，带负电荷的BSA难以吸附在氧化膜表面，随着Cl-(或真实环境中的机械摩擦)对氧化膜的破坏，溶解的金属离子与BSA结合，形成的复合物脱离表面进入溶液，加速腐蚀；如果沉积在材料表面，就会提高其耐蚀性能。对钛合金而言，BSA形成的复合物沉积在表面后降低了氧化层的硬度，但提高了材料在PBS中的耐蚀性能。根据模型推测，蛋白质与金属的结合方式有2种：一种是裸金属与蛋白质之间的结合。骨或牙植入体受到机械摩擦时，裸露的金属表面与蛋白质接触，这时金属离子与蛋白质的结合相对较快；另一种情况是金属氧化物与蛋白质的结合。静态下，金属材料表面存在氧化物，当蛋白质-金属之间的结合键强于金属-氧之间的结合键时，蛋白质可与金属连接(过程缓慢)。金属氧化物之间的化学键被减弱，蛋白质-金属复合物可能会脱离表面(过程更慢)[88,89]，从而加速腐蚀。但是这种情况的发生需要有较强的驱动力，比如高浓度的蛋白质、搅拌、高离子强度，或通过Vroman效应——小分子蛋白质先吸附在材料表面，之后被大分子蛋白质取代[90]。对于可降解金属材料——镁合金，在研究中发现了类似的腐蚀机理[79]。镁合金接触溶液时，H+和OH-优先到达表面生成Mg(OH)2。Cl-攻击氧化层导致Mg2+溶解，然后吸引溶液中带负电的BSA。BSA与Mg2+的结合又会加速其溶解。

图9

图9BSA吸附过程中，钛合金/液体界面之间电荷转移的理论模型[55]

Fig.9Theoretical model of charged double layer showing the transfer of charge at the metal/oxide/protein interfaces before (a) and during (b) the corrosion process[55]

3结语

蛋白质在医用金属材料表面的吸附以及对腐蚀行为的影响存在很多不确定性。蛋白质的吸附是一个动态过程，但是目前，缺乏理想的实时监测手段观察蛋白质如何从溶液到达金属表面、吸附、再脱离表面，以及此过程中分子构型的变化、分子之间的聚集或是与其他离子的结合等。大部分的研究结论都是基于对吸附前后材料表面的分析或对电化学测试结果的推理，而缺乏可靠的实验证据。因此，只能间接推断蛋白质的吸附机理，而缺乏在分子水平上的数据验证。分子动力学模拟为这种表征提供了可能，但是模拟过程也会受到多种条件的限制，只能研究一种蛋白质在固体表面的吸附，无法考虑蛋白质浓度的影响以及其他有机分子及离子存在时对吸附的影响。

对于蛋白质对金属材料腐蚀过程的影响，目前缺乏理想的体外测试标准，尤其是可降解金属材料，之前的测试标准(针对惰性金属材料)或许已经不再适用。首先，目前常用的模拟体液中无机盐成分本来就存在成分和含量上的差异，溶液中离子强度的不同会影响蛋白质与金属材料表面的相互作用，进而影响材料的腐蚀行为。因此，在现有的模拟体液中加入蛋白质可能会造成更多实验结果上的差异。其次，缺少对金属表面反应的实时监测。比如，蛋白质吸附在金属表面后，氧化膜的破坏与生成、蛋白质如何参与到腐蚀产物中、腐蚀产物的生成与溶解等，都缺少直接的检测方法。另外，现有的体外测试中使用的蛋白质主要以BSA为主，而在人体内的不同位置，蛋白质的种类以及浓度并不相同。比如，血液中蛋白质的浓度要高于组织液，而在血浆中就包含血清蛋白、血红蛋白等多种蛋白质。因此，需要根据植入材料的目标位置选择蛋白质的种类以及浓度。多种蛋白质及其他有机分子同时存在时，还需要考虑金属表面是否会受到蛋白质与其他分子之间相互作用的影响。此外，不同功能的医用金属材料在体内也会受流体和机械载荷的影响，如骨植入体承受人体活动时产生的摩擦、股骨支架承受循环弯曲载荷，心血管支架会受到血液冲刷、血管壁的循环张力负荷；牙种植体则需要考虑口腔内咀嚼时的载荷等。但是在目前的体外测试中，对材料腐蚀性能的评价主要以静态浸泡和电化学测试为主，缺少对人体内动态环境以及负载的模拟。最后，对比图1和表6可以发现，现有的测试数据中，大部分镁合金的体外降解速率高于体内降解速率；而在体外测试中加入蛋白质后，材料的腐蚀速率可能会进一步加快，导致体内外测试的数据差异更大。这说明蛋白质可能不是影响金属材料腐蚀的唯一因素，现有的体外测试方法仍需进一步改善。

理想的体外测试结果有助于对金属材料的体内腐蚀行为做出合理的预测。因此，体外测试的设计要接近体内真实环境。具有相同功能的植入材料，可使用相同的模拟体液(含蛋白质)，以减小不同实验室之间的差异，获得更具说服力的结果。另外，可灵活设置体外模拟体液中的成分及其含量，便于研究某些成分对金属材料腐蚀过程的影响，了解材料的腐蚀机理，或对材料的耐蚀性能进行初步的评价、对比和筛选。另外，可尝试使用荧光显微镜观察蛋白质在金属表面的吸附与分布情况，利用原子力显微镜-电化学装置观察蛋白质吸附时金属材料的腐蚀情况。在生物体内，细胞、组织等的新陈代谢与金属材料的降解之间也可能会存在相互作用，但是在体外模拟这些生理环境存在一定的难度。因此，对医用金属材料的体内测试仍是不可忽略的部分。当体内外测试的数据足够多时，对比金属材料体内外腐蚀速率的差异，并找出相关的影响因素，从而建立体内外腐蚀速率之间的关系公式。这将为预测金属材料在体内的腐蚀速率提供可靠、有效的依据。

综上所述，体外测试作为对医用金属材料腐蚀性能的初步评价方式，有必要考虑溶液中的蛋白质在材料表面的吸附及其对腐蚀行为的影响，以减少体内外测试结果的差异，更加合理地预测医用金属材料在体内的腐蚀行为。

来源--金属学报