龙莹莹,刘 婷,王庆伟,鲁 彦,许 旭∗ (上海应用技术大学 化学与环境工程学院,上海 ２０１４１８)

摘 要:建立了高精度胶束毛细管电动色谱法同时测定牛磺酸滴眼液中牛磺酸和羟苯乙酯含量 的方法.移取牛磺酸滴眼液样品５．０mL,用水定容至１０mL,超声混匀,经０．２２μm 微孔滤膜过 滤,取续滤液,得到待测样品溶液.选择带隔离槽的石英毛细管柱(内径７５μm,总长度６５cm,有 效长度４５cm),以含２０mmol??L－１十二烷基硫酸钠的硼砂Ｇ硼酸缓冲液(pH９．０,１５mmol??L－１) 的混合液为分离缓冲液,在分离电压为－１５kV,检测波长为２１０nm 的条件下进行电泳分离.结 果显示:牛磺酸的质量浓度在５．０２~４０．８０g??L－１内,羟苯乙酯质量浓度在０．０５０~０．３３３g??L－１内 与其各自对应的峰面积呈线性关系,检出限分别为１．２,０．００５g??L－１;牛磺酸和羟苯乙酯混合标准 溶液的日内精密度(n＝６)均小于２．０％,日间精密度(n＝６)均小于４．０％;对实际样品进行加标回 收试验,牛磺酸的回收率为９３．９％~１１１％,羟苯乙酯的回收率为８５．３％~１０７％.方法用于３批牛 磺酸滴眼液的分析,牛磺酸和羟苯乙酯的测定值与其标示量基本一致.

关键词:胶束毛细管电动色谱法;滴眼液;牛磺酸;羟苯乙酯

中图分类号:O６５７．８ 文献标志码:A 文章编号:１００１Ｇ４０２０(２０２２)０１Ｇ０００１Ｇ０６

牛磺酸是成熟视网膜中不可缺少的一种含硫氨 基酸[１Ｇ３].牛磺酸滴眼液主要用于由牛磺酸代谢失 调引起的白内障治疗,也可用于急性结膜炎、疱疹性 结膜炎、病毒性结膜炎的辅助治疗.由于滴眼液一 般为多剂量包装,通常需要添加抑菌剂来抑制微生 物生长[４],常用的抑菌剂为羟苯酯类化合物,如羟苯 甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯等.«中华人民共和国药 典»(２０１５年版)(简称 ChP２０１５)中规定眼用制剂 中可以加入适量的抑菌剂,但是没有对添加量做具 体限度.长时间过量使用抑菌剂,会对眼部带来上 皮细胞损伤、免疫反应等安全隐患,因此需要对其含 量进行控制.

由于牛磺酸的紫外吸收较弱,ChP２０１５中其含 量的测定方法为氨基酸分析法和柱后衍生高效液相 色谱法,但柱后衍生步骤繁琐,且衍生反应要在聚四 氟乙烯反应管中进行,对仪器的配置要求较高;除此 之外,测定牛磺酸的方法还有高效液相色谱法[４Ｇ６]、自动电位滴定法[７]、分光光度法[８]等.另外文献中 报道的滴眼液中抑菌剂的测定方法有高效液相色谱 法[９Ｇ１２]、气相色谱Ｇ质谱法[１３]、超高效液相色谱Ｇ串联 质谱法[１４]等.胶束毛细管电动色谱法可以同时分 离分析带电荷的离子成分与不带电荷的中性成分, 可用于同时测定牛磺酸滴眼液中牛磺酸和抑菌剂羟 苯乙酯的含量.

本工作利用高精度定量毛细管电泳仪,通过优 化电泳分离、缓冲试剂等条件,建立了胶束毛细管电 动色谱法同时测定牛磺酸滴眼液中牛磺酸和抑菌剂 羟苯乙酯含量的方法.

１ 试验部分

１．１ 仪器与试剂

qCETMＧ３０１０型高精度定量毛细管电泳仪,配紫 外检测器、高压电源、注射泵、四通手动纳升级定量 阀进样器及色谱工作站;TUＧ１９０１型紫外Ｇ可见分光 光度计;MilliＧQ 型纯水机. 混合标准储备溶液:称取适量的牛磺酸标准品 和羟苯乙酯标准品,置于１０mL 容量瓶中,加入适 量甲醇溶解,再用水稀释至刻度,经０．２２μm 微孔滤膜过滤,配制成牛磺酸质量浓度为５０g??L－１、羟苯 乙酯质量浓度为 １g??L－１ 的混合标准储备溶液. 使用时,用水稀释５倍左右,需要时可加入适量硫脲 (电渗流标志物).

硼砂Ｇ硼酸缓冲液(pH９．０):称取适量的十水合 四硼酸钠和硼酸,用水溶解并定容至１００mL,配制 成硼酸盐浓度为１５mmol??L－１的硼砂Ｇ硼酸缓冲液 (pH９含．０２０).

含．０２０).mmol??L－１十二烷基硫酸钠(SDS)的硼 砂Ｇ硼酸缓冲液(pH９．０)的混合液:称取适量的SDS 标准品,用硼砂Ｇ硼酸缓冲液(pH９．０)溶解,配制成 含２０ mmol??L－１ SDS 的 硼 砂Ｇ硼 酸 缓 冲 液 (pH ９．０)的混合液.

牛磺酸标准品的质量分数为９９％,羟苯乙酯标 准品的质量分数为９９％,SDS标准品的质量分数为 ９９％;乙腈、甲醇均为色谱纯;十水合四硼酸钠、硼 酸、硫脲均为分析纯;试验用水为超纯水.

１．２ 仪器工作条件

带隔离槽的石英毛细管柱(内径７５μm,总长度 ６５cm,有效长度 ４５cm);缓冲液为含 ２０ mmol?? L－１ SDS的硼砂Ｇ硼酸缓冲液(pH９．０)的混合液;分 离电压－１５kV;检测波长２１０nm;进样量１０nL

使用新的毛细管柱之前,先用甲醇、０．１ mol?? L－１氢氧化钠溶液、水、０．１mol??L－１盐酸溶液等淋 洗液依次冲洗毛细管柱各５ min,每次换淋洗液前 需要用水进行过渡;活化结束后,再用缓冲液平衡毛 细管柱１０min.

１．３ 试验方法

移取牛磺酸滴眼液样品 ５．０ mL,加水定容至 １０mL容量瓶中,超声混匀,经０．２２ 滤,取续滤液,得到待测样品溶液. μm 微孔滤膜过

仪器开机后依次用０．１ mol??L－１ 氢氧化钠溶 液、水、缓冲液冲洗毛细管柱,以保证系统的重复性 和稳定性,再按照仪器工作条件进样分析,两次进样 之间用缓冲液冲洗毛细管柱.测定结束后,用１０％ (体积分数)甲醇溶液对毛细管柱进行清洗.

２ 结果与讨论

２．１ 色谱分离行为

按照仪器工作条件对混合标准溶液、样品溶液 和空白溶液进行测定,所得电泳图见图１.

结果显示,在该电泳条件下,各组分均能达到基 线分离,且与电渗流分离效果良好.其中硫脲是一 种不电离且不易进入胶束的中性物质,可作为电渗 流标志物直观地表征电渗流的出峰位置,通过考察 硫脲与待测组分的分离情况,有助于避免可能存在 的中性干扰

２.2检测波长的选择

牛磺酸和羟苯乙酯在波长１９０~３００nm 内的 紫外Ｇ可见吸收光谱图见图２. 结果显示:羟苯乙酯在２１０,２５４nm 处均有紫 外吸收;而牛磺酸的紫外吸收较弱,仅在２００nm 附 近存在末端吸收.为保证牛磺酸和羟苯乙酯均有较 好的信噪比,试验选择检测波长为２１０nm.

２．３ 缓冲液体系的选择

试缓验冲考液察体了系磷的酸选盐择缓冲液体系和硼砂缓冲液体 系(硼砂、硼砂Ｇ硼酸、硼砂ＧSDS、硼砂Ｇ硼酸ＧSDS)对 硫脲、牛磺酸和羟苯乙酯分离效果的影响. 结果显示:含有硼砂的缓冲液更适用于硫脲、牛 磺酸和羟苯乙酯的分离,且基线稳定,但单独的硼砂 体系中牛磺酸和羟苯乙酯的分离度难以达到要求; 而当以硼砂Ｇ硼酸ＧSDS为缓冲液体系时,硫脲、牛磺 酸和羟苯乙酯之间的分离度均能达到要求.因此, 试验选择以硼砂Ｇ硼酸ＧSDS为缓冲液体系. 、

２．４缓冲液度的选择

试验考察了硼砂~硼酸缓冲液中硼酸盐浓度分结果表明:随着缓冲液浓度的增大,硫脲与牛磺 酸的分离度越来越好,而牛磺酸与羟苯乙酯的分离 度呈下降趋势,原因可能是当缓冲液浓度较高时,电 流增大,引起焦耳热增加而降低柱效、增大基线噪 声;当缓冲液浓度为１５mmol??L－１时,各待测组分 的分离度、基线和峰形均能满足测定要求.因此,试验选择缓冲液浓度为１５mmol??L－１.

２．５ 缓冲液酸度的选择

试验考察了缓冲液酸度(pH 分别为 ８．４,８．７, ９．０,９．３)对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯的迁移时间和分 离度的影响,结果见图４. 结果表明:随着缓冲液pH的增大,硫脲与牛磺 酸的分离度逐渐增大,而牛磺酸与羟苯乙酯的分离 度逐渐下降;并且在试验过程中发现,当缓冲液pH 较低时,牛磺酸的峰形不对称,有明显的拖尾现象, 柱效较低;当缓冲液 pH 较高时,电流大,焦耳热现 象明显;当缓冲液pH 为９．０时,硫脲、牛磺酸、羟苯 乙酯之间的分离度较好,峰形较好,且基线平稳.因 此,试验选择缓冲液pH 为９．０.

２．６ SDS浓度的选择

试 验 考 察 了 含 有 不 同 浓 度 (１０,２０,３０, ４０mmol??L－１)SDS的硼砂Ｇ硼酸缓冲液(pH９．０) 对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯迁移时间和分离度的影 响,结果见图５. 结果显示:当 SDS浓度较低时,硫脲与牛磺酸 的分离度较好,但牛磺酸与羟苯乙酯的分离度较低; 随着SDS浓度的增加,牛磺酸与羟苯乙酯的分离度 逐渐增 大,但 较 高 浓 度 的 SDS 会 使 电 流 增 大;当 SDS浓度为２０ mmol??L－１ 时,硫脲、牛磺酸、羟苯 乙酯之间的分离效果较好,分析时间和电流大小合 适.因此,试验选择SDS的浓度为２０mmol??L－１.

２．７ 分离电压的选择

试验 考 察 了 分 离 电 压 为 －８,－１２,－１５, －１８kV 时对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯的迁移时间和 分离度的影响,结果见图６. 结 果表明:当分离电压绝对值较低时,硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯之间分离度较小,分析时间较长;当 分离电压绝对值较高时,电流较大,产生的焦耳热影 响柱效,且基线不稳,影响测定结果的精密度.综合 考虑,试验选择分离电压为－１５kV.

２．８ 标准曲线、检出限和测定下限

配制 牛 磺 酸 质 量 浓 度 为 ５．０２,７．４６,１０．９０, １５．８０,３１．６０,４０．８０g??L－１,羟苯乙酯质量浓度为 ５０,１００,１６７,２００,２５０,３３３ mg??L－１ 的标准溶液系 列.按照仪器工作条件对上述标准溶液系列进行测 定,以各目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面 积为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表１. 对标准溶液进行稀释,以信噪比(S/N)为３时 的质量浓度作为检出限,以信噪比(S/N)为１０时的 质量浓度作为测定下限,结果见表１.

２．９ 精密度试验

按照仪器工作条件对混合标准溶液连续测定 ６次,计算各目标物迁移时间和峰面积的相对标准 偏差(RSD),以考查方法的日内精密度.结果显示, 牛磺酸和羟苯乙酯迁移时间的 RSD分别为０．３０％, ０．３０％,峰 面 积 的RSD分 别 为１．５％,１．７％,表 明 本 方法有较好的精密度. 按照仪器工作条件对同一溶液连续测定６d,计 算各目标物迁移时间和峰面积的 RSD,以考查方法 的日间精密度.结果显示,６d内,牛磺酸和羟苯乙 酯迁移时间的 RSD 分别为１．２％,１．６％,峰面积的 RSD分别为３．５％,３．６％本工作在高精度定量毛细管电泳仪上配置纳升 级定量阀进样器,改善了进样体积精度,配合使用毛 细管 温 控 系 统,峰 面 积 重 复 性 RSD 通 常 小 于 ２．０％[１５Ｇ１７],与普通的毛细管电泳仪(RSD 约 ３．０％ 或更大)相比,显著改善了定量的重复性.

２．１０ 回收试验

按照试验方法对实际牛磺酸滴眼液样品进行加 标回收试验,每个浓度水平制备３个平行样(牛磺酸 通过称重加标,羟苯乙酯通过标准溶液加标),计算 回收率,结果见表２.

２．１１ 样品分析

按照试验方法对某制药厂生产的不同批次的牛 磺酸滴眼液(牛磺酸标示量为５０g??L－１,羟苯乙酯 标示量为０．２５g??L－１)本工作采用高精度定量毛细管电泳仪,建立了 胶束毛细管电动色谱法同时测定牛磺酸滴眼液中牛 磺酸和羟苯乙酯含量的方法.该方法操作简单、分 离效果好、精密度高,可用于牛磺酸滴眼液样品中牛 磺酸和羟苯乙酯的同时测定.

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